Les stratégies de stabilisation et de normalisation de l’urine favorisent une analyse impartiale du contenu urinaire en EV

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 17663 (2022) Citer cet article

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L'urine constitue une source idéale de marqueurs diagnostiques non invasifs. Certains problèmes intrinsèques et méthodologiques posent encore des obstacles à son plein potentiel en tant que substrat de biopsie liquide. Contrairement au sang, la concentration urinaire varie en fonction de la nutrition, de l’hydratation et de facteurs environnementaux. L'urine est enrichie en EV provenant des voies génito-urinaires, tandis que sa conservation, sa purification et sa normalisation peuvent introduire un biais dans l'analyse des sous-ensembles d'EV dans les comparaisons inter et intra-individuelles. La présente étude a évalué les méthodes qui réduisent ces biais, telles que le stockage approprié et réalisable de l'urine, la méthode optimale de purification de l'EV en une seule étape pour la récupération des protéines et des ARN à partir de petits volumes d'urine et une méthode de normalisation pour l'analyse quantitative des ARN de l'EV urinaire. L'ultracentrifugation, la précipitation chimique et l'immuno-affinité ont été utilisées pour isoler les véhicules électriques de l'urine de donneurs sains conservée congelée ou à température ambiante pendant 6 mois maximum. Plusieurs paramètres biochimiques et EV de l’urine, notamment le nombre de particules et la teneur en protéines, ont été comparés sur des échantillons d’urine. À cette fin, une analyse de suivi des nanoparticules (NTA) et une évaluation des protéines par des tests BCA, ELISA et WB ont été réalisées. Ces mesures ont été corrélées aux abondances relatives d'ARNm et de miARN EV sélectionnés, évaluées par RT-PCR et classées en fonction de leur capacité à refléter et à corriger les variations de la teneur en EV dans les échantillons d'urine longitudinaux. Toutes les méthodes de purification ont permis la récupération et l’analyse en aval des véhicules électriques à partir d’à peine 1 ml d’urine. Nos résultats mettent en évidence la stabilité à long terme des ARN EV lors du stockage de l'urine à température ambiante, ainsi qu'une excellente corrélation entre la teneur en EV dans l'urine et certaines caractéristiques biochimiques mesurées en routine, telles que les protéines urinaires totales et l'albumine, mais pas la créatinine, la plus classiquement utilisée pour la normalisation de l'urine. L'évaluation comparative de l'ARNm et des miARN dans les isolats d'EV a révélé des ARN spécifiques, en particulier RNY4 et un petit panel de miARN, dont les niveaux reflétaient bien la variation inter-échantillons d'EV et étaient donc utiles comme normalisateurs post-analytiques possibles de la teneur en ARN EV. Nous décrivons des solutions réalistes de traitement et de normalisation de l'urine pour une lecture impartiale des études de biomarqueurs EV et des échantillonnages et diagnostics cliniques de routine, fournissant ainsi une contribution à la conception d'études de validation plus vastes utilisant les EV urinaires comme biomarqueurs pour des conditions et des maladies particulières.

L'urine est une source attrayante et intéressante de marqueurs de diagnostic potentiellement précieux pour un ensemble de conditions cliniques, en particulier celles affectant le tractus urogénital, telles que les maladies ou lésions rénales, et les cancers urogénitaux. En outre, les biomarqueurs urinaires ont également montré un potentiel pour des pathologies non urologiques1,2 telles que d'autres cancers (par exemple le cancer du sein ou du poumon), des troubles métaboliques et endocriniens (par exemple le diabète), des affections inflammatoires (par exemple l'athérosclérose et l'arthrose) et même des maladies neurodégénératives ou neuropsychiatriques. maladies. L'utilisation des analyses d'urine pour diagnostiquer des maladies est une pratique ancienne (par exemple détection du glucose chez les sujets diabétiques en le goûtant ou en attirant des fourmis, ou détection de l'albumine comme indicateur d'une maladie rénale par un « test à la mousse ») et est restée une composante sous-jacente. de la médecine investigatrice tout au long du 20e et du début du 21e siècle3. Avec l’avènement des techniques modernes d’omique, une myriade de composants urinaires est révélée dont les altérations quantitatives et qualitatives devraient avoir une valeur diagnostique et prédictive dans le domaine clinique.

Paradoxalement, l’urine est encore peu étudiée en tant que source totalement non invasive de biomarqueurs de biopsie liquide pouvant être utilisés longitudinalement pour le diagnostic et la surveillance. Ce paradoxe est dû aux caractéristiques particulières de ce biofluide, et aux obstacles méthodologiques qui gênent encore le passage des candidats biomarqueurs à la prérogative quantitative de validation et de mise en œuvre de tests diagnostiques.